蛋白質(zhì)定量(比色法)
蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物,比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分:氨基酸(如酪氨酸,絲氨酸)與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng),產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān),從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。
常用的比色方法一般有BCA,Bradford,Lowry 等幾種方法。
Lowry 法:
以zui早期的Biuret 反應(yīng)為基礎(chǔ),并有所改進(jìn)。蛋白質(zhì)與Cu2+反應(yīng),產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物。但是與Biuret相比,Lowry 法敏感性更高。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑;反應(yīng)需要的時(shí)間較長;容易受到非蛋白物質(zhì)的影響;含EDTA,Triton x-100,ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。
BCA(Bicinchoninine acid assay)法:
這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2+反應(yīng)產(chǎn)生Cu+,后者與BCA形成螯合物,形成紫色化合物,吸收峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系*,反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對于Lowry法,操作簡單,敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。
Bradford 法:
這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng),產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其zui大的特點(diǎn)是,敏感度好,是Lowry 和BCA 兩種測試方法的2 倍;操作更簡單,速度更快;只需要一種反應(yīng)試劑;化合物可以穩(wěn)定1小時(shí),方便結(jié)果;而且與一系列干擾Lowry,BCA 反應(yīng)的還原劑(如DTT,巰基乙醇)相容。但是對于去污劑依然是敏感的。zui主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大,無可比性。
某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結(jié)果并不一致,感到迷惑,究竟該相信哪種方法?由于各種方法反應(yīng)的基團(tuán)以及顯色基團(tuán)不一,所以同時(shí)使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如:Keller等測試人奶中的蛋白,結(jié)果Lowry,BCA 測出的濃度明顯高于Bradford,差異顯著。即使是測定同一樣品,同一種比色法選擇的標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致,測試后的濃度也不一致。如用Lowry測試細(xì)胞勻漿中的蛋白質(zhì),以BSA作標(biāo)準(zhǔn)品,濃度1.34mg/ml,以a球蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品,濃度2.64mg/ml。因此,在選擇比色法之前,是參照要測試的樣本的化學(xué)構(gòu)成,尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品。另外,比色法定量蛋白質(zhì),經(jīng)常出現(xiàn)的問題是樣品的吸光值太低,導(dǎo)致測出的樣品濃度與實(shí)際的濃度差距較大。關(guān)鍵問題是,反應(yīng)后1011分光光度計(jì)的重要配件—— 比色皿的顏色是有一定的半衰期,所以每種比色法都列出了反應(yīng)測試時(shí)間,所有的樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)樣品),都必須在此時(shí)間內(nèi)測試。時(shí)間過長,得到的吸光值變小,換算的濃度值降低。
可能存在的誤差:
反應(yīng)溫度、溶液PH值等都是影響實(shí)驗(yàn)的重要原因。此外,非常重要的是,是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色皿,因?yàn)榉磻?yīng)后的顏色會讓石英或者玻璃著色,導(dǎo)致樣品吸光值不準(zhǔn)確。